納米抗體(Nanobody，Nb)是僅存在于駱駝科動物(如駱駝、羊駝)和鯊魚中的天然缺失輕鏈和重鏈恒定區(qū)1(CH1)的特殊抗體，具有分子量小、穩(wěn)定性高、組織穿透力強等優(yōu)勢，在疾病診斷、治療和基礎研究等領域展現出巨大潛力。
 

　　在納米抗體制備過程中，需要注意以下關鍵事項：
 

　　1.抗原設計與制備
 

　　抗原純度：高純度的抗原能夠減少免疫動物對雜質蛋白的免疫反應，提高特異性納米抗體的產生幾率。例如，通過親和層析、離子交換層析等純化技術，將抗原的純度提高到95%以上。
 

　　抗原構象：盡量保持抗原的天然構象，通常識別抗原的天然表位。如果抗原在制備過程中發(fā)生變性或構象改變，可能會導致免疫動物產生的抗體無法識別天然狀態(tài)下的抗原。例如，對于一些蛋白質抗原，可以采用溫和的提取和純化方法，避免使用強酸、強堿或高溫等可能導致蛋白質變性的條件。
 

　　2.cDNA合成與抗體基因擴增
 

　　逆轉錄酶選擇：選擇保真性好的逆轉錄酶進行cDNA合成，以保證cDNA的完整性和準確性。不同的逆轉錄酶可能對RNA的模板要求不同，應根據實驗條件進行優(yōu)化。
 

　　引物設計：設計特異性引物用于擴增納米抗體的可變區(qū)基因。引物的設計要考慮到抗體基因的保守序列，同時避免引物二聚體和非特異性擴增?？梢酝ㄟ^生物信息學軟件對引物的特異性、Tm值等參數進行分析和優(yōu)化。
 

　　PCR擴增條件：優(yōu)化PCR擴增條件，包括退火溫度、延伸時間、循環(huán)次數等，以提高抗體基因的擴增效率和特異性。過高的退火溫度可能導致擴增效率降低，而過低的退火溫度則可能增加非特異性擴增。
 

　　3.篩選方法的選擇
 

　　固相篩選與液相篩選：根據抗原的性質和實驗需求選擇合適的篩選方法。固相篩選適用于純化的抗原固定在固相載體上，操作相對簡單；液相篩選則更接近天然狀態(tài)下的抗原-抗體相互作用，能夠篩選到親和力更高的納米抗體。例如，對于一些小分子抗原，液相篩選可能更為合適。
 

　　篩選輪次與嚴格度：通常進行3-4輪篩選，每輪篩選逐漸增加篩選的嚴格度，如減少抗原的用量、增加洗滌次數或延長洗滌時間等，以富集高親和力的納米抗體。但篩選輪次不宜過多，否則可能會導致抗體多樣性的喪失。