在重組蛋白中，常常將目的蛋白N端或C端與其他特定蛋白、多肽或寡肽標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，形成既能保留天然蛋白的大部分結(jié)構(gòu)，又能實(shí)現(xiàn)增溶，防降解，促進(jìn)分泌，便于純化的功能；本文簡(jiǎn)要介紹生物藥研發(fā)生產(chǎn)過(guò)程中常見(jiàn)的融合蛋白標(biāo)簽；

一、純化標(biāo)簽

His標(biāo)簽

His標(biāo)簽是當(dāng)前流行的標(biāo)簽蛋白。His標(biāo)簽是指六個(gè)組氨酸殘基組成的融合標(biāo)簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當(dāng)某一個(gè)標(biāo)簽的使用，一是能構(gòu)成表位利于檢測(cè)；二是構(gòu)成*的結(jié)構(gòu)特征（結(jié)合配體）利于純化。其特點(diǎn)可總結(jié)為以下幾點(diǎn)：

1.標(biāo)簽的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分別為~26KD和~30KD，一般不影響目標(biāo)蛋白的功能； 2.His標(biāo)簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強(qiáng)的蛋白得到應(yīng)用，后者在純化包涵體蛋白時(shí)特別有用，用高濃度的變性劑溶解后通過(guò)金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復(fù)性不受其它蛋白的干擾，或進(jìn)行金屬螯和親和層析復(fù)性； 3.His標(biāo)簽融合蛋白也被用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究； 4.His標(biāo)簽免疫原性相對(duì)較低，可將純化的蛋白直接注射動(dòng)物進(jìn)行免疫制備抗體；

5.可應(yīng)用于多種表達(dá)系統(tǒng)，純化的條件溫和；

6.可以和其它的親和標(biāo)簽一起構(gòu)建雙親和標(biāo)簽。

純化：組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強(qiáng)烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析(IMAC)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離純化。

GST標(biāo)簽

GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶) 標(biāo)簽蛋白本身是一個(gè)在解毒過(guò)程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為26KD。將它應(yīng)用在原核表達(dá)的原因大致有兩個(gè)，一個(gè)是因?yàn)樗且粋€(gè)高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一個(gè)是它可以在大腸桿菌中大量表達(dá)，起到提高表達(dá)量的作用。結(jié)合的融合蛋白在非變性條件下用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫。在大多數(shù)情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二聚體。GST標(biāo)簽可用酶學(xué)分析或免疫分析很方便的檢測(cè)。標(biāo)簽有助于保護(hù)重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。在大多數(shù)情況下GST融合蛋白是*或部分可溶的。

純化：該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的GST標(biāo)簽蛋白可直接從細(xì)菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和樹(shù)脂進(jìn)行純化。GST標(biāo)簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會(huì)失去對(duì)谷胱甘肽樹(shù)脂的結(jié)合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強(qiáng)變性劑如：鹽酸胍或尿素等。如果要去除GST融合部分，可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。

MBP標(biāo)簽

MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）標(biāo)簽蛋白大小為40kDa，由大腸

桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加在細(xì)菌中過(guò)量表達(dá)的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP標(biāo)簽可通過(guò)免疫分析很方便地檢測(cè)。有必要用位點(diǎn)專一的蛋白酶切割標(biāo)簽。如果蛋白在細(xì)菌中表達(dá)，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。

純化：融合蛋白可通過(guò)交聯(lián)淀粉親和層析一步純化。結(jié)合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進(jìn)行洗脫。結(jié)合親和力在微摩爾范圍。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效結(jié)合，而其他融合蛋白則不受影響。緩沖條件為pH7.0到8.5，鹽濃度可高達(dá)1M，但不能使用變性劑。如果要去除MBP融合部分，可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。

FLAG標(biāo)簽

FLAG標(biāo)簽蛋白為8個(gè)氨基酸（DYKDDDDK）的融合多肽，同時(shí)載體中構(gòu)建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率更高。

純化：FLAG作為融合表達(dá)標(biāo)簽，其通常不會(huì)與目的蛋白相互作用并且通常不會(huì)影響目的蛋白的功能、性質(zhì)；融合FLAG的目的蛋白，可以直接通過(guò)FLAG進(jìn)行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并且純化效率高。FLAG還作為標(biāo)簽蛋白，可以被抗FLAG的抗體識(shí)別，這樣就方便通過(guò)Western Blot、ELISA等方法對(duì)含有FLAG的融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)、鑒定。.融合在N端的FLAG，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。

Avi 標(biāo)簽

AviTag標(biāo)簽蛋白是一個(gè)15 個(gè)氨基酸的短肽，具有一個(gè)單生物素化賴氨酸位點(diǎn)，與已知天然可生物素化序列*不同，可以加在目標(biāo)蛋白的N端和C端。融合表達(dá)后，可被生物素連接酶生物素化，為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物；

特點(diǎn)： 1.無(wú)論在體外或者體內(nèi)，幾乎所有的蛋白都可以在一個(gè)*的Avi Tag位點(diǎn)輕易且有效地被生物素化；

2.生物素化是通過(guò)酶和底物的反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，反應(yīng)條件相當(dāng)溫和而且標(biāo)記的專一性*； 3.生物素AviTag只有15個(gè)氨基酸，對(duì)蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響非常小。

SUMO標(biāo)簽

SUMO標(biāo)簽蛋白是一種小分子泛素樣修飾蛋白（Small ubiquitin-likemodifier），是泛素(ubiquitin)類多肽鏈超家族的重要成員之一。在一級(jí)結(jié)構(gòu)上，SUMO與泛素只有18%的同源性，然而兩者的三級(jí)結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能卻十分相似。研究發(fā)現(xiàn)SUMO可以作為重組蛋白表達(dá)的融合標(biāo)簽和分子伴侶，不但可以進(jìn)一步提高融合蛋白的表達(dá)量，且具有抗蛋白酶水解以及促進(jìn)靶蛋白正確折疊，提高重組蛋白可溶性等功能。

Halo Tag

HaloTag標(biāo)簽蛋白是一種脫鹵素酶的遺傳修飾衍生物，可與多種合成的HaloTag配基有效地共價(jià)結(jié)合。這個(gè)分子量為33KDa的單體蛋白能融合在重組蛋白的N端或C 端，并在原核和真核系統(tǒng)中表達(dá)。HaloTag配基是小分子化學(xué)物，能夠在體外或體內(nèi)與HaloTag蛋白共價(jià)結(jié)合。

SNAP Tag

是新一代的蛋白標(biāo)簽技術(shù)，不僅專一性*而且穩(wěn)定，優(yōu)點(diǎn)是適用于多種環(huán)境下的蛋白質(zhì)檢測(cè)與純化，如活細(xì)胞內(nèi)、溶液中、或固態(tài)相(如SDS-PAGE gels)等。

SNAP-Tag是從人的O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）獲得。無(wú)論體內(nèi)還是體外，SNAP-Tag都能與底物高特異性地共價(jià)結(jié)合，使蛋白標(biāo)記上生物素或熒光基團(tuán)（如熒光素和若丹明）。SNAP所帶的活性巰基位點(diǎn)接受了苯甲基鳥(niǎo)嘌呤所攜帶的側(cè)鏈苯甲基基團(tuán)，釋放出了鳥(niǎo)嘌呤。這種新的硫醚鍵共價(jià)結(jié)合使SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團(tuán)所帶的標(biāo)記物。苯甲基鳥(niǎo)嘌呤在生化條件下穩(wěn)定，并且沒(méi)有其他蛋白會(huì)和這類物質(zhì)作用，所以SNAP標(biāo)簽反應(yīng)是高特異的。

純化 ：將純化的或未純化的SNAP-Tag融合蛋白與表面固定了苯甲基鳥(niǎo)嘌呤的基質(zhì)混合，蛋白即可特異與底物作用，形成共價(jià)鍵，融合蛋白間接被固定在了基質(zhì)表面上，可以達(dá)到更方便快捷地研究蛋白功能或純化蛋白的目的。

二、報(bào)告標(biāo)簽

c-Myc標(biāo)簽

C-Myc標(biāo)簽蛋白，是一個(gè)含11個(gè)氨基酸的小標(biāo)簽，標(biāo)簽序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，這11個(gè)氨基酸作為抗原表位表達(dá)在不同的蛋白質(zhì)框架中仍可識(shí)別其相應(yīng)抗體。C-Myc tag已成功應(yīng)用在 Western-blot雜交技術(shù)、免疫沉淀和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)中, 可用于檢測(cè)重組蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的表達(dá)。

HA標(biāo)簽

HA標(biāo)簽蛋白，標(biāo)簽序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的紅細(xì)胞凝集素表面抗原決定簇，9個(gè)氨基酸，對(duì)外源靶蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響小, 容易構(gòu)建成標(biāo)簽蛋白融合到N端或者C端。

常用Anti－HA抗體檢測(cè)和ELISA檢測(cè)。

熒光素酶

來(lái)源于生物體內(nèi)的熒光素，常見(jiàn)的有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶和Guassia熒光素酶。這些熒光素酶作為“報(bào)告蛋白”被用于分子生物學(xué)研究中，這種技術(shù)被稱為報(bào)告基因檢測(cè)法或螢光素酶檢測(cè)法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白標(biāo)簽不同，使用熒光素酶構(gòu)建的報(bào)告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究啟動(dòng)子、miRNA 3'UTR克隆的功能與調(diào)控，因?yàn)樗鼈儗?duì)目的基因的調(diào)控可以是漸變的，而不是簡(jiǎn)單的開(kāi)和關(guān)兩種狀態(tài)。

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，檢測(cè)幅度寬；不是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源性基因；重復(fù)性好；與HTS兼容等。螢火蟲和海腎熒光素酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于協(xié)同報(bào)告并進(jìn)行均一化研究。由于它們都是快速，容易和高靈敏的監(jiān)測(cè)方法。而且螢火蟲和海腎熒光素酶是理想的雙基因報(bào)告系統(tǒng)，因?yàn)樗鼈儊?lái)源于不同的生物進(jìn)化方向，蛋白結(jié)構(gòu)和底物差異都很大，在實(shí)驗(yàn)中不會(huì)產(chǎn)生相互影響。

熒光標(biāo)簽蛋白

包括eGFP/eCFP/eYFP/eCherry,具有不同的激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)，均由野生型熒光蛋白通過(guò)氨基酸突變和密碼子優(yōu)化而來(lái)。就eGFP而言，相對(duì)于GFP，其熒光強(qiáng)度更強(qiáng)、熒光性質(zhì)更穩(wěn)定。同時(shí)載體中構(gòu)建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率更高。mCherry是從DsRed演化來(lái)的性能好的一個(gè)單體紅色熒光蛋白，可以和GFP系列熒光蛋白共用，實(shí)現(xiàn)多色標(biāo)記體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白時(shí)，熒光蛋白活性和被融合的目標(biāo)蛋白功能相互沒(méi)有明顯影響。這些熒光標(biāo)簽蛋白，其融合表達(dá)目的蛋白后具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.不用破碎組織細(xì)胞和不加任何底物，直接通過(guò)熒光顯微鏡就能在活細(xì)胞中發(fā)出綠色熒光，實(shí)時(shí)顯示目的基因的表達(dá)情況，而且熒光性質(zhì)穩(wěn)定，被譽(yù)為活細(xì)胞探針。

2.其自發(fā)熒光，不需用目的基因的抗體或原位雜交技術(shù)就可推知目的基因在細(xì)胞中的定位等情況。

3.同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的其它產(chǎn)物不會(huì)干擾標(biāo)簽蛋白檢測(cè)，從而使其檢測(cè)更顯得快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高而且重現(xiàn)性。

4.其低消耗、高靈敏度檢測(cè)，十分適用于高通量的藥物篩選。因此現(xiàn)eGFP 表達(dá)標(biāo)簽被廣泛地應(yīng)用于基團(tuán)表達(dá)調(diào)控、轉(zhuǎn)基因功能研究、蛋白在細(xì)胞中的功能定位、遷移變化及藥物篩選等方面。

5.mCherry紅色熒光蛋白在標(biāo)記病毒顆粒，研究病毒和宿主細(xì)胞之間更有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。如用mRFP或mCherry標(biāo)記HIV病毒顆粒，研究HIV和宿主細(xì)胞問(wèn)的相互作用以及HIV侵染宿主細(xì)胞的過(guò)程．用mRFP標(biāo)記慢病毒顆粒，研究慢病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制過(guò)程等。

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