蛋白表達(dá)技術(shù)已滲透到生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。越來越多的基因被發(fā)現(xiàn)，其中多數(shù)基因功能不明，利用蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。常見的蛋白表達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌/原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)、酵母/真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)、植物蛋白表達(dá)系統(tǒng)。
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如果希望得到能行使功能的蛋白，蛋白應(yīng)該以可溶形式表達(dá)。避免包涵體形成的方法很多，比如選用表達(dá)量不高的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，選擇有助于可溶性表達(dá)的融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)等，使用基本培養(yǎng)基等也有助于可溶性表達(dá)。另一個(gè)容易忽視的問題是大腸桿菌內(nèi)還原性過高會(huì)導(dǎo)致二硫鍵不能正確形成，同樣容易導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物不溶，更換菌株有助于解決這個(gè)問題。
大腸桿菌蛋白表達(dá)試驗(yàn)中需要注意哪些事項(xiàng)？
1.所有操作盡量在冰上操作，以避免蛋白質(zhì)發(fā)生變性。
2.根據(jù)自己的需要選擇不同的表達(dá)載體，并注意不同的表達(dá)載體上的融合標(biāo)簽和攜帶的抗性基因，其中有些標(biāo)簽是可以去除的。
3.構(gòu)建好的載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，保證讀碼框正確，即沒有移碼。
4.長(zhǎng)期保存的pET重組子在高濃度甘油中會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定。
5.37℃生長(zhǎng)常常會(huì)使一些蛋白累積形成包涵體，而30℃生長(zhǎng)則可能產(chǎn)生可溶的和有活性的蛋白。在某些情況下，低溫（15－20℃）延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間可以使溶解性蛋白的產(chǎn)量達(dá)到大。
6.進(jìn)行SDS-PAGE分析時(shí)，需優(yōu)化電泳上樣體積。
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更新時(shí)間：2020-06-04
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