制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機(jī)會(huì)增加，同時(shí)可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應(yīng) 根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質(zhì)不穩(wěn)定，提純時(shí)易變性，或其免疫原性很強(qiáng)，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化 或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強(qiáng)時(shí)，則必須對(duì)抗原進(jìn)行純化。檢測用抗原可以是與 免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。
多抗具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和激活吞噬細(xì)胞，升高外周白細(xì)胞的作用，能提高骨髓造血機(jī)能和機(jī)體應(yīng)激能力。
1、免疫
用生理鹽水稀釋免疫原，然后與相應(yīng)的佐劑進(jìn)行1:1混合?？乖妥魟?混合形成穩(wěn)定的乳劑，將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進(jìn)行皮下注射和后大腿進(jìn)行肌肉注射。每個(gè)區(qū)域大約用1/4的免疫原。這樣免疫原可以持久存在從而提高免疫應(yīng)答。
注：
抗原注射以前需要收集一些正常血清，已備檢測抗體時(shí)作為陰性對(duì)照。待兔子在新環(huán)境中穩(wěn)定，大概需要四天左右時(shí)間，可以進(jìn)行耳動(dòng)脈取血。取血量約5ml足矣。
免疫用的抗原必須純化，否則影響抗體的質(zhì)量?？乖?jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射。將抗原液與佐劑等比例混合后，置于混合器上使之劇烈振蕩使抗原充分乳化，乳化過程比較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，但若乳化不充分，會(huì)影響免疫的效果，振蕩后，1000rpm離心一分鐘，如水相和油相不分層即可注射。免疫用FCA，以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多點(diǎn)注射法。即于家兔脊柱兩旁選4-6點(diǎn)皮下注射，每點(diǎn)注0.1ml，間隔2周后再于上述部位選不同點(diǎn)注射（不要選擇臨近位點(diǎn)，否則潰瘍愈合不好）。每次免疫的抗原量約100μg。免疫次數(shù)在四五次即可，抗原用量大可以減少次數(shù)。
2、取血：
免疫一周后，可以耳動(dòng)脈取血檢測抗體效價(jià)。因?yàn)槠鸪鯉状蚊庖弋a(chǎn)生的抗體的效價(jià)比較低，頭兩次取血，夠檢測用即可。在三次免疫后，可以獲得較價(jià)的抗體，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否則會(huì)造成兔子貧血。
前幾次取血用19號(hào)針頭對(duì)兔子進(jìn)行耳動(dòng)脈取血，室溫過夜析出血清。
一次取血可以采用頸動(dòng)脈放血，具體操作如下：
(1)、家兔仰臥于兔架上固定頭部，用紗布固定四肢。頭部略放低以暴露頸部。剃毛并消毒皮膚。
(2)、沿頸部中線用手術(shù)刀切開皮膚約250px，分離皮下結(jié)締組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突肌（小心操作，如碰到小血管出血，可用止血鉗止血）。
(3)、用直頭止血鉗分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動(dòng)脈后用彎頭眼科鑷使之游離，剝離神經(jīng)和結(jié)締組織。
(4)、于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動(dòng)脈用血管夾夾住。
(5)、用小拇指墊在血管下，用尖頭眼科手術(shù)剪在兩根絲線間的動(dòng)脈璧上剪一小口（勿剪斷），插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫。
(6)、松開止血鉗，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。
3、血清的分離
如果用三角瓶或平皿盛血，將器皿傾斜放置于37oC烘箱2h，轉(zhuǎn)移到4oC沉淀過夜，第二天早上用吸管吸取血清。如果用離心管收集，37oC烘箱放置2h，轉(zhuǎn)移到4oC沉淀過夜，第二天早上離心，10000RCF，10分鐘。在血清中加入NaN3 至終濃度0.02%，分裝后-20oC保存。
雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測?？贵w檢測的方法很多，通常根據(jù)所研究的抗原和 實(shí)驗(yàn)室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測方法必須具有快速、準(zhǔn)備、簡便，便于一次處理大量樣品等特點(diǎn)。因?yàn)橥袔装賯€(gè)樣品需要在短短幾個(gè)小時(shí)就報(bào) 告結(jié)果，以便決定雜交瘤細(xì)胞的取舍。所以選用抗體檢測方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費(fèi)小和節(jié)省人力。一般說來，在融合之前就必須建立好抗體檢測 方法，并克服可能存在的問題。
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更新時(shí)間：2021-06-21
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